Dans cette page, vous trouverez une description détaillée
de mon parcours professionnel depuis le début de mon doctorat,
ainsi que la liste de publications qui en découle.
1.
Travail de thèse
: maladie de Huntington et thérapie génique
En
1994, j'ai rejoint le laboratoire CNRS dirigé par le Dr Jacques
Mallet afin d'y effectuer mon stage de DEA. Mon choix s'est à
l'époque porté sur ce laboratoire car on m'y donnait
l'opportunité d'aborder deux domaines m'intéressant tout
particulièrement : les neurosciences et la discipline naissante
de la thérapie génique. À ce moment, plusieurs
équipes, dont celle de Jacques Mallet, venaient de
démontrer qu'un vecteur dérivé de
l'adénovirus permettait de transférer du matériel
génétique in vivo
dans les neurones, ouvrant la voie
à la thérapie génique pour les maladies
neurodégénératives comme la maladie de Parkinson.
Ce laboratoire s'est donc également orienté vers le
transfert de gènes thérapeutiques pour une autre maladie
neurodégénérative : la maladie de Huntington. J'ai
eu pour rôle l'élaboration de statégies de
thérapie génique pour cette affection
génétique. Dans un premier
temps, j'ai étudié le transfert du gène de la
glutamate décarboxylase (GAD), l'enzyme de biosynthèse du
GABA qui est le neurotransmetteur déficient dans la maladie de
Huntington. Dans un second temps, je me suis intéressé
à l'effet neuroprotecteur du transfert de gènes
neurotrophiques dans des modèles pharmacologiques de la maladie
de Huntington développés chez le rongeur. C'est cette
deuxième approche qui a donné les résultats les
plus prometteurs.
La maladie de Huntington est due à une
mutation par amplification de triplets CAG dans la séquence
codante du gène IT15, et fait donc partie du groupe des maladies
génétiques à polyglutamine. Bien que le
gène soit exprimé de manière ubiquitaire dans
l'organisme, la cytotoxicité due à sa mutation ne
s'observe principalement que dans les neurones GABAergiques de
projection du noyau caudé et du putamen (réunis en une
seule structure appelée striatum chez le rat). La
dégénérescence de ces neurones entraîne des
troubles de l'humeur, une démence et des mouvements
incontrôlés (chorée) apparaissant le plus souvent
chez l'adulte. Cette maladie dévastatrice aboutit au
décès du patient après une évolution sur
dix à quinze ans en moyenne.
La perte des neurones GABAergiques entraîne
une déficience en GABA au sein du striatum. Au début de
ce travail, une des pistes thérapeutiques était donc de
restaurer ce niveau de GABA au sein de cette structure anatomique afin
de diminuer les symptômes, comme peut le faire la dopamine dans
le cas de la maladie de Parkinson. Dans ce but, j'ai utilisé les
cellules progénitrices nerveuses HiB5. Immortalisées de
manière conditionnelle, ces cellules se cultivent à
33°C et, une fois transplantées, arrêtent de se
diviser sous l'effet de la température. In vitro, j'ai transduit
ces cellules à l'aide d'un vecteur adénoviral exprimant
la GAD et permettant d'obtenir un taux de transduction proche de 100%.
Le dosage de l'activité enzymatique glutamate
décarboxylase m'a permis de montrer que les cellules transduites
exprimaient un fort taux de GAD. J'ai greffé ces cellules dans
le striatum de rats ayant subi une lésion par l'acide
iboténique, une toxine spécifique des neurones
GABAergiques. Par une étude histologique, j'ai montré que
les cellules présentes au cœur de la greffe expriment le
transgène, alors que les cellules ayant colonisé le
striatum hôte ont perdu cette expression. La greffe de cellules
préalablement marquées par la thymidine tritiée a
indiqué que cette colonisation de l'organisme hôte par les
cellules HiB5 s'accompagne de divisions cellulaires,
phénomène très probablement à l'origine de
la perte du vecteur adénoviral qui ne se maintient dans les
cellules que sous forme d'épisomes.
Parallèlement à ce travail, je me suis
également intéressé à la possibilité
de protéger les neurones du striatum de la mort cellulaire. Le
stress excitotoxique et le dysfonctionnement du métabolisme
énergétique sont suspectés d'être à
l'origine de la dégénérescence des neurones du
striatum. Ils partagent la caractéristique de conduire tous deux
à une élévation des radicaux libres,
délétère pour les cellules. In vitro, j'ai pu
montrer que la surexpression de la superoxyde dismutase (SOD), une
enzyme de la voie de détoxification des radicaux libres,
à l'aide d'un adénovirus recombinant permet de
protéger des cultures primaires issues de striatum embryonnaire
d'un stress excitotoxique (publication 1). Ces
travaux n'ont cependant pas été appliqués à
des modèles in vivo,
car une neuroprotection du striatum dans sa globalité aurait
nécessité de transduire une très forte proportion
des neurones de cette structure, ce qui n'était pas envisageable
avec les vecteurs adénoviraux de première
génération dont je disposais. Je me suis donc
tourné vers des facteurs diffusibles, capables de
protéger les cellules voisines des cellules transduites. Pour
cette stratégie les facteurs neurotrophiques GDNF (Glial-Derived
Neurotrophic Factor) et BDNF (Brain-Derived Neurotrophic Factor), deux
facteurs qui augmentent la survie et stimulent la
différenciation de nombreux neurones. Ce sont de bons candidats
pour protéger les neurones du striatum. J'ai donc construit des
vecteurs adénoviraux exprimant ces facteurs afin
d'étudier l'effet de leur surexpression dans le modèle de
maladie de Huntington induit par injection de quinolinate dans le
striatum de rat. Le BDNF a montré les meilleurs résultats
dans ce modèle, permettant à la fois une
amélioration des performances des animaux dans le test
locomoteur de "Paw-Reaching" et une prévention de la mort
neuronale observable sur le plan histologique (publication
2). Cette série d'expérience m'a également
permis de montrer que les qualités du vecteur de transfert de
gène sont essentielles pour mener à bien ce type de
projets. J'ai ainsi mis en évidence que la réaction
inflammatoire due à l'injection intracérébrale du
vecteur adénoviral de première génération a
une influence importante sur le modèle de lésion
aiguë par le quinolinate. J'ai donc consacré la fin de mon
travail de thèse à la mise au point de vecteur
lentiviraux dérivés de HIV-1 qui sont peu
immunogéniques. Comparé au vecteur adénoviral, ce
type de vecteur entraîne une réponse inflammatoire minime
après injection dans le système nerveux central du
rongeur.
2.
BioVectys SA : chef de projet "Business development"
En décembre 1999, à l'issue de ma
thèse, le Dr Jacques Mallet m'a proposé de faire partie
de l'équipe de BioVectys, une société de
biotechnologie en cours de création et ayant pour objectif la
mise au point de produits de thérapie génique pour les
maladies neurodégénératives. J'ai fait partie de
cette société en tant que chef de projet pendant quatre
ans, avec pour principale mission la participation à la
définition des objectifs, la rédaction du "business
plan", la rencontre des investisseurs, ainsi que la mise en place d'un
réseau de collaboration avec plusieurs laboratoires
académiques. J'ai été en charge de rédiger
des projets de recherche qui ont par la suite été
subventionnés par l'agence nationale pour la valorisation de la
recherche (ANVAR, année 2000), le ministère de la
recherche (années 2000 et 2001) et l'association
Rétina-France (années 2002 et 2003), permettant ainsi de
couvrir les salaires d'un chercheur et d'un technicien.
Outre mes activités concernant le
développement de la société, j'avais des
responsabilités sur le plan scientifique qui visaient à
poursuivre le travail de vectorologie entamé à la fin de
ma thèse sur les vecteurs lentiviraux, et à assurer la
production de ces vecteurs pour plusieurs projets de recherches dans le
domaine des neurosciences. Pour cela, j'ai supervisé un
ingénieur de recherche ayant pour tâche d'optimiser et de
standardiser la production des vecteurs lentiviraux. Nous avons ainsi
établi un "process" permettant d'obtenir des virus de
qualité pré-clinique et à haut titre infectieux de
manière reproductible. L'utilisation de ces différents
vecteurs grâce à différentes collaborations a
donné lieu à plusieurs publications qui mettent en
évidence le fort potentiel thérapeutique des vecteurs
lentiviraux pour les maladies neurologiques (publications
5, 7, 8 et 11). Au cours de cette période, j'ai
également
mené à terme mes propres projets de recherches
entamés au cours de ma thèse : en collaboration avec
l'équipe du Dr Pierre Gressens (INSERM U676, Paris), j'ai pu
montrer que le BDNF a un effet neuroprotecteur sur les lésions
excitotoxiques du cortex de la souris nouveau-né, un
modèle du développement pathologique qui peut survenir
chez le grand prématuré. Ce résultat a
été confirmé par injection de la protéine
recombinante (publication 3) et par
administration périnatale d'un vecteur lentiviral exprimant le
BDNF (publication 9). J'ai également
poursuivi mon travail sur la maladie de Huntington, et, grâce
à l'utilisation du modèle induit par le quinolinate, nous
avons pu montrer avec l'équipe du Dr Philippe Hantraye (URA
CEA/CNRS 2210, Orsay), qu'un autre facteur neurotrophique, l'IGF-1,
permet de protéger les neurones du striatum chez le rat (publication 4).
Un des objectifs de la société
Biovectys était d'obtenir des vecteurs lentiviraux permettant de
cibler différents types cellulaires particuliers de
manière spécifique. J'ai été en charge
d'étudier la possibilité d'obtenir de tels vecteurs par
pseudotypage, une manipulation qui consiste à substituer la
glycoprotéine d'enveloppe du vecteur par une autre afin de
modifier son tropisme. Classiquement, lors de leur production, ces
vecteurs sont pseudotypés par VSV-G, la glycoprotéine
d'enveloppe du virus de la stomatite vésiculaire (VSV). Ce
pseudotypage permet d'étendre le tropisme du vecteur à un
très grand nombre de types cellulaires, mais aussi d'obtenir des
particules virales plus résistantes et donc plus faciles
à manipuler. En collaboration avec l'unité CNRS 7091,
nous avons testé le pseudotypage des vecteurs lentiviraux par la
glycoprotéine d'enveloppe du virus mokola ainsi que celles de
deux souches différentes du virus de la rage. Dans un premier
temps, nous avons pu transduire des cellules in vitro, démontrant ainsi
qu'il était possible de pseudotyper les vecteurs lentiviraux par
ces protéines d'enveloppes. A l'aide de différentes
lignées cellulaires spécifiques, nous avons montré
que ces nouveaux pseudotypes transduisaient les cellules nerveuses de
manière plus efficace que les cellules d'autres origines. J'ai
donc étudié le tropisme de ces vecteurs
pseudotypés après injection dans le système
nerveux central du rat. Les résultats obtenus avec l'enveloppe
du virus mokola ont été les plus intéressants,
puisque nous avons montré un tropisme de ce pseudotype
très largement spécifique des astrocytes. Par ailleurs,
un vecteur ciblant les cellules gliales serait en effet très
intéressant d'un point de vue clinique. Une publication
récapitulant ces résultats est en cours de
préparation. De plus, en collaboration avec l'équipe du
Dr Philippe Hantraye, nous avons étendu ces résultats au
primate en comparant le tropisme des pseudotypes VSV-G ou mokola-G
après injection intracérébrale des vecteurs chez
des macaques. La publication des résultats de cette étude
est également en cours de préparation.
Les maladies de la rétine font partie des
pathologies dont le traitement par thérapie génique est
envisagé par la société BioVectys. Je me suis donc
également intéressé à l'apport du
pseudotypage des vecteurs lentiviraux pour le ciblage des cellules de
la rétine. En collaboration avec l'équipe du Dr Marc
Abitbol (Hôpital Necker), j'ai traité des rats adultes par
injection d'un vecteur lentiviral dans l'espace sous-rétinien.
La mesure de la réponse électrorétinographique de
ces animaux a montré que l'injection des vecteurs viraux
n'entraîne pas de troubles fonctionnels. Les études
d'histologie nous ont permis de montrer que : (1) les vecteurs
pseudotypés par la protéine d'enveloppe du virus de la
rage ne sont que très peu infectieux pour les cellules de la
rétine ; (2) comme décrit dans la littérature
scientifique, les vecteurs pseudotypés par VSV-G transduisent
avec une forte efficacité l'épithélium pigmentaire
de la rétine, et les photorécepteurs dans une moindre
mesure ; (3) en revanche, les vecteurs pseudotypés par mokola-G
présente l'intéressante particularité de ne
transduire que les cellules de l'épithélium pigmentaire,
et ceux avec une grande efficacité (publication
6). Cette étude démontre le fort potentiel clinique
du pseudotypage des vecteurs lentiviraux par l'enveloppe mokola-G dans
le cadre des pathologies de l'épithélium pigmentaire de
la rétine. Cette stratégie permet en effet d'obtenir un
transfert de gène strictement restreint aux cellules
présentant un dysfonctionnement.
L'ensemble de ces travaux menés sur les
vecteurs de transfert de gène dérivés des
lentivirus illustre l'intérêt de ces vecteurs tant en
termes d'efficacité thérapeutique sur plusieurs
modèles de maladies neurologiques (publications
5, 7, 8, 9 et 11), qu'en termes d'ingénierie permettant
d'améliorer la biosécurité en restreignant le
tropisme (publication 6 et en cours de
préparation).
Au début de l'année 2004, j'ai rejoint
l'équipe dirigée par le Dr Yvan Arsenijevic au sein de
l'hôpital ophtalmique Jules-Gonin à Lausanne (Suisse) afin
notamment de prendre en charge un projet de recherche ayant pour
objet la mise au point d'une stratégie de thérapie
génique pour l'amaurose congénitale de Leber, une maladie
génétique de la rétine.
3.
Hôpital
ophtalmique de Lausanne : thérapie génique de la
rétine
L'hôpital ophtalmique Jules-Gonin est le service d'ophtalmologie
du CHUV (Centre Hospitalier Universitaire Vaudois) de Lausanne. Il
comprend une unité de recherche ayant pour objet l'exploration
de nouvelles voies de traitement pour les pathologies de la
rétine (Unité de Thérapie Génique et de
Biologie des Cellules Souches). J'ai intégré ce groupe en
tant que "médecin de recherche" en charge des projets de
thérapie génique, pour lesquels je supervise le travail
de deux techniciennes de laboratoire et d'une étudiante en
doctorat. J'ai également la charge d'assurer la
visibilité du laboratoire en exposant notre travail dans les
principaux congrès internationaux (American Society of Gene
Therapy, Association for Research in Vision and Ophthalmology…) et de
rechercher les fonds nécessaires à notre fonctionnement
auprès de fondations subventionnant la recherche (Association
Française contre les Myopathies, Foundation Fighting Blindness,
Juvenile Diabetes Research Foudation…).
Sur le plan scientifique, notre projet de
recherche principal concerne l'amaurose congénitale de
Leber, une rétinite pigmentaire se caractérisant par une
déficience visuelle importante présente dès
l'enfance et aboutissant rapidement à la cécité.
Dans 10 à 15% des cas, la maladie est due à une mutation
dans le gène RPE65, qui est exprimé spécifiquement
dans l'épithélium pigmentaire de la rétine.
L'enzyme RPE65 est un maillon clé dans le recyclage du
11-cis-retinal, le chromophore nécessaire pour la conversion du
stimulus lumineux en signal électrique par les
photorécepteurs. Cette pathologie étant récessive,
il apparaît tout à fait réaliste d'obtenir un effet
thérapeutique par transfert d'une copie non mutée du
gène RPE65 dans les
cellules de l'épithélium
pigmentaire. Il a ainsi été montré qu'un vecteur
AAV (adeno-associated virus) codant le gène RPE65 permet de
restaurer la vision de chiens portant une mutation spontanée de
ce gène. Les travaux déjà réalisés
par différentes équipes ont abouti à l'ouverture
de deux essais cliniques qui sont en cours aux USA.
Dans une perspective clinique, l'effet du transfert
de gène sur les différents types de
photorécepteurs, cônes et bâtonnets, est un point
critique. Ce sont les cônes qui permettent la perception des
couleurs et surtout l'acuité visuelle. La fovéa,
région centrale de la rétine, est en effet
composée essentiellement de cônes. Cependant, l'effet du
transfert de gène RPE65 sur les cônes n'a
été que très peu étudié. Nous avons
donc entrepris de réaliser cette étude en utilisant une
lignée de souris KO pour le gène Rpe65 et des vecteurs
lentiviraux afin de cibler l'épithélium pigmentaire de la
rétine.
Dans un premier temps, un vecteur lentiviral
exprimant le transgène sous le contrôle d'un fragment du
promoteur du gène Rpe65
a été construit.
L'utilisation du gène rapporteur GFP a permis de montrer que ce
vecteur permet de transduire les cellules de l'épithélium
pigmentaire avec une grande efficacité. J'ai
réalisé le transfert du gène Rpe65 chez les souris
Rpe65-/- grâce à
ce vecteur, et montré une
restauration de l'activité de la rétine mesurée
par électrorétinographie. Dans ce modèle animal,
les cônes ont presque totalement
dégénéré à 1 mois. J'ai donc
entrepris une analyse histologique de plusieurs marqueurs de ces
cellules sur des animaux âgés de 4 mois, après
traitement par administration du vecteur Rpe65 5 jours après la
naissance. Cette expérience a montré que le transfert du
gène Rpe65 conduit
à une préservation
complète des cônes dans la zone traitée. De plus,
j'ai pu mettre en évidence l'existence d'une zone
intermédiaire de la rétine, non-transduite mais
bénéficiant cependant de l'effet thérapeutique sur
les cônes, sans doute par diffusion du chromophore 11-cis-retinal
en dehors de la zone transduite. Les mesures
stéréologiques que j'ai effectuées ont
montré que l'étendue de cette zone intermédiaire
est strictement proportionnelle à l'étendue de la zone
transduite par le gène thérapeutique. Ce résultat
pourrait avoir une grande portée clinique, car il devrait
permettre en théorie de calculer la zone de rétine
périphérique à traiter par transfert de
gène pour obtenir un effet thérapeutique au niveau de la
fovéa.
Pour montrer que cet effet sur les cônes s'observe
également sur le plan fonctionnel, j'ai utilisé une
seconde lignée de souris double KO pour Rpe65 et Gnat1.
L'invalidation de ce dernier gène, la transducine des
bâtonnets, bloque la cascade de phototransduction dans ces
cellules, permettant ainsi d'enregistrer la réponse des
cônes. Alors que la réponse
électrorétinographique des souris Rpe65-/- Gnat1-/-
non-traitées est inexistante, le transfert du gène Rpe65
permet de restaurer une réponse provenant des cônes.
L'ensemble de ces résultats indique que le transfert du
gène RPE65 a un
potentiel thérapeutique important qui
devrait permettre de redonner leur fonction aux cônes chez
l'homme, et donc pourrait améliorer de manière important
l'acuité visuelle des patients. Ces résultats sont
résumés dans les publications
n°10 et 12.
Actuellement, je continue cette étude en
parallèle sur la lignée de souris Rpe65-/- et sur une
nouvelle souche portant la mutation Rpe65R91W/R91W, analogue à celle
retrouvée chez une partie des patients atteints d'amaurose
congénitale de Leber, avec pour objectif principal de montrer
que le transfert de gène permet d'améliorer la vue des
souris. Pour cela je développe une version modifiée du
labyrinthe de Morris (Morris water maze) et un tambour
optocinétique pour rongeur, deux tests comportementaux
basés sur la vision. Dans ce dernier test, les
expériences en cours réalisées avec des souris
Gnat1-/- qui ne
possèdent pas de bâtonnets fonctionnels,
indiquent qu'il est possible, en variant l'intensité de la
lumière ambiante, de quantifier indépendamment la
réponse motrice entraînée par la stimulation des
bâtonnets de celle qui est due à la stimulation des
cônes. Ce résultat nous permet de penser que : (1) ces
tests montreront que les animaux recouvrent la vue grâce au
traitement par transfert de gène ; (2) cette restauration de la
vision pourra être démontré aussi bien pour les
cônes que pour les bâtonnets. Avec l'étude
toxicologique de l'administration sous-rétinienne du vecteur
lentiviral sur le gros animal, l'étude comportementale en cours
sur la souris sera la dernière étape avant l'application
de cette thérapie génique chez des patients, qui pourront
êtres traités à l'hôpital ophtalmique
Jules-Gonin de Lausanne.
4.
Liste de
pulications
N'hésitez
pas à me contacter
pour obtenir des tirés-à-parts (version
électronique).
- Barkats
M., Bemelmans A.-P.,
Geoffroy M.-C., Robert J.-J., Loquet I., Horellou P., Revah F., Mallet
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neurones against glutamate toxicity. Neuroreport,
7:497-501.
- Bemelmans
A.-P., Horellou
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neurotrophic factor-mediated protection of striatal neurons in an
excitotoxic rat model of Huntington's disease, as demonstrated by
adenoviral gene transfer. Hum Gene
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